晶體-細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)：腎結(jié)石研究的模型

腎結(jié)石/尿石癥（即腎結(jié)石?。┤匀皇且粋€(gè)全球公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率/患病率不斷上升。腎結(jié)石最常見的化學(xué)成分是草酸鈣，它通過結(jié)晶、晶體生長、晶體聚集、晶體細(xì)胞粘附和通過腎間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)侵入來引發(fā)結(jié)石形成。在這些過程中，晶體-細(xì)胞相互作用（定義為“細(xì)胞通過粘附在細(xì)胞表面或內(nèi)化到細(xì)胞中的晶體的任何方式的影響而改變細(xì)胞的現(xiàn)象，伴隨著晶體的變化，例如，細(xì)胞誘導(dǎo)的生長，粘合能力，降解等”）對于晶體在腎臟中的保留非常重要。在過去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于腎結(jié)石研究，旨在更好地了解腎結(jié)石形成的致病機(jī)制。本文概述了該領(lǐng)域的當(dāng)前知識，并總結(jié)了從所有將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于晶體-細(xì)胞相互作用研究的研究中獲得的數(shù)據(jù)，這些研究隨后導(dǎo)致了功能研究，以解決表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)在腎結(jié)石疾病發(fā)病機(jī)制中的顯著影響或功能作用。

1.引言

腎結(jié)石病仍然是一種常見的人類疾病，在全球發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都可以找到[1，2，3]。腎結(jié)石主要由含鈣晶體組成，特別是草酸鈣（CaOx）一水合物（COM）和二水合鈣（COD）[1，2，3]。腎結(jié)石形成的機(jī)制過程相當(dāng)復(fù)雜，涉及結(jié)晶、晶體生長、晶體聚集、晶體細(xì)胞粘附以及通過腎間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）侵入晶體[4，5，6]。結(jié)晶既可以在腎小管內(nèi)（管內(nèi)模型）內(nèi)發(fā)生，也可以發(fā)生在腎間質(zhì)（蘭德爾斑塊模型）[4，5，6]。晶體形成后，單個(gè)晶體通過晶體生長或聚集機(jī)制成為較大的顆粒[7，8]。此外，晶體-細(xì)胞粘附導(dǎo)致晶體潴留到腎小管或間質(zhì)內(nèi)[9，10]。粘附的晶體可以內(nèi)化到腎小管細(xì)胞中進(jìn)行降解，反之亦然，通過炎癥級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)石形成過程[11，12]。最后，在腎間質(zhì)中形成的內(nèi)化晶體可以使用纖溶酶-纖溶酶原途徑[13]通過ECM侵入或遷移到其他部位，隨后引發(fā)組織炎癥和侵蝕[14，15]。

有趣的是，晶體保留和結(jié)石形成的關(guān)鍵過程之一是晶體-細(xì)胞粘附步驟，需要“晶體-細(xì)胞相互作用”，這可以在這里定義為細(xì)胞被粘附在細(xì)胞表面或內(nèi)化到細(xì)胞中的晶體的任何影響而改變的現(xiàn)象，伴隨著晶體的變化，例如，細(xì)胞誘導(dǎo)的生長、粘合能力、降解等。使用術(shù)語“相互作用”是通過晶體和細(xì)胞之間的“相互作用”來邏輯的。很明顯，晶體可以引起細(xì)胞中的許多變化，從輕度到重度細(xì)胞毒性[14，15，16]。另一方面，細(xì)胞的組成，特別是在頂端表面和內(nèi)吞囊泡中，會(huì)影響晶體的生長，粘合能力和降解[17，18]。這種相互作用可以增強(qiáng)腎內(nèi)晶體的保留和晶體進(jìn)入腎小管細(xì)胞的內(nèi)吞作用。此外，晶體-細(xì)胞相互作用也可導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷和炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)石形成過程[14，15，16]。

在蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于各種腎臟疾病[19，20，21]。在過去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于腎結(jié)石疾?。ㄓ绕涫荂OM和COD類型）的研究，旨在更好地了解腎結(jié)石形成的致病機(jī)制[22，23]。本文總結(jié)了所有將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于晶體-細(xì)胞相互作用研究的研究，這些研究隨后導(dǎo)致了功能研究，以解決表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)在腎結(jié)石疾病發(fā)病機(jī)制中的顯著影響或功能作用。請注意，這些研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)從結(jié)石形成者中鑒定尿液或腎結(jié)石基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，而沒有任何證據(jù)表明“晶體-細(xì)胞相互作用”（見上面的定義），被排除在本評價(jià)之外（因?yàn)槠渲性S多蛋白質(zhì)只是與尿液中的結(jié)石調(diào)節(jié)劑混合，或者只是在結(jié)石腫大期間通過停滯卡在結(jié)石基質(zhì)內(nèi)，而在結(jié)石發(fā)病機(jī)制中沒有任何作用）。腎結(jié)石研究中與CaOx晶體-細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的所有相關(guān)研究總結(jié)在表1并討論如下。

表1與CaOx晶體-細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的所有相關(guān)研究摘要。

年作者/參考文獻(xiàn)晶體-細(xì)胞相互作用的條件蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)/功能檢測主要發(fā)現(xiàn)不同劑量和類型的CaOx晶體對腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響2008塞曼戈恩等[24]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COM

培養(yǎng)：48小時(shí)2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜11種上調(diào)和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝和生長，核和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，運(yùn)輸，應(yīng)激反應(yīng)和生物合成中發(fā)揮作用。2008通布克德五世等[25]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：1000μg/mL COM孵育：48小時(shí)2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜鑒定出25種上調(diào)和23種下調(diào)蛋白質(zhì)。當(dāng)伴侶被上調(diào)時(shí)，參與蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)的其他蛋白質(zhì)被下調(diào)。2008塞曼戈恩T等[26]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COD

孵育：48小時(shí)2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜5種上調(diào)和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，控制細(xì)胞代謝，結(jié)構(gòu)，完整性，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)。2010陳S等[27]]細(xì)胞：HK-2細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：200μg/mL COM

培養(yǎng)：12小時(shí)2-DE銀二胺染色，LC-靜電放電微粒/微粒9種上調(diào)和3種下調(diào)蛋白質(zhì)，在能量產(chǎn)生，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，鈣平衡和蛋白質(zhì)合成中起作用。2011蔣宗華等[28]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COD

孵育：48小時(shí)2-DE、Pro-Q祖母綠糖蛋白染色、西普羅紅寶石總蛋白染色、Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜在16種顯著改變的糖蛋白中，3個(gè)蛋白酶體亞基的糖型上調(diào)，而肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白3（ARP3）的糖型下調(diào)。2012柴亞里特S等[29]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（純化的線粒體）

晶體：100微克/毫升COM

孵育：48小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜，氧合分印跡測定12種上調(diào)和3種下調(diào)線粒體蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，新陳代謝和能量產(chǎn)生。COM晶體還誘導(dǎo)線粒體功能障礙和氧化修飾蛋白在細(xì)胞中的積累。2017維奈法特A等[30]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100/1000μg/mL COD/COM

培養(yǎng)：48小時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，熒光素-熒光素酶ATP測定，氧化印跡測定，泛素化蛋白質(zhì)的測量，細(xì)胞死亡測定和晶體-細(xì)胞粘附測定與低劑量相比，高劑量的這些晶體引起細(xì)胞蛋白質(zhì)組更明顯的變化，并且COM比COD更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變。用高劑量處理的細(xì)胞具有更高水平的細(xì)胞內(nèi)ATP，氧化修飾蛋白和細(xì)胞死亡，但泛素化蛋白水平較低。COM也誘發(fā)比COD更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。用抗氧化劑EGCG對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可以降低晶體誘導(dǎo)的氧化修飾蛋白的積累和細(xì)胞的晶體結(jié)合能力。2018皮拉彭P等[31]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：1000μg/mL COM孵育：48小時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析、增殖測定、傷口愈合測定、氧化印跡測定、熒光素-熒光素酶ATP測定和經(jīng)上皮耐藥性（TER）測量用1000μg/mL COM晶體處理的細(xì)胞毒性細(xì)胞在細(xì)胞增殖，傷口愈合能力，TER以及緊密連接蛋白zonula閉塞-1（ZO-1）和信號蛋白RhoA的水平方面存在降低。相反，細(xì)胞內(nèi)ATP和氧化修飾蛋白的水平升高。腎小管細(xì)胞頂端表面COM晶體受體的蛋白質(zhì)組鑒定2011方恩根等[32]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（純化的頂端膜）

晶體：COM

孵育：過夜甲基纖維素/質(zhì)譜、Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜、晶體細(xì)胞粘附測定、抗體中和測定共鑒定出96個(gè)潛在的COM晶體受體。膜聯(lián)蛋白II作為COM晶體受體的作用通過使用特異性抗體的中和測定得到證實(shí)。2012舒替蓬坦酸S等[33]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘，72小時(shí)2-DE、西普魯比紅寶石染色、Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜分析、晶體-細(xì)胞粘附測定、鈣誘導(dǎo)測定、抗體中和測定膜聯(lián)蛋白A1作為COM晶體受體。2013坎拉亞R等[34]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

培養(yǎng)：30分鐘，72小時(shí)2-DE、西普羅紅寶石染色、Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜、晶體細(xì)胞粘附測定、草酸鹽誘導(dǎo)試驗(yàn)、抗體中和測定A-烯醇化酶作為COM晶體受體。2016皮拉彭P等[35]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測定、鈣誘導(dǎo)測定膜聯(lián)蛋白A1作為COM晶體受體。2016方恩根等[36]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（整個(gè)細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：1小時(shí)晶體細(xì)胞粘附測定、抗體中和測定A-烯醇化酶作為COM晶體受體。2016方恩根等[37]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

培養(yǎng)：1小時(shí)，48小時(shí)晶體-細(xì)胞粘附測定、晶體內(nèi)化測定、抗體中和測定、小干擾RNA（siRNA）敲低蛋白質(zhì)HSP90用作COM晶體受體。2016馬尼索恩J等[38]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測定、蛋白質(zhì)過表達(dá)、草酸鹽誘導(dǎo)測定A-微管蛋白過表達(dá)導(dǎo)致三種COM晶體受體的下調(diào)，包括α烯醇化酶，HSP70和HSP90，并降低了細(xì)胞的晶體結(jié)合能力。2016彭薩庫爾N等[39]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測定、siRNA蛋白質(zhì)敲低、草酸鹽誘導(dǎo)測定層粘連蛋白A/C敲低導(dǎo)致四種COM晶體受體的水平降低，包括維生素A，α烯醇化酶，S100和膜聯(lián)蛋白A2，并且細(xì)胞的晶體結(jié)合能力下降。2018馬尼索恩J等[40]]細(xì)胞：HEK293T細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COM

培養(yǎng)：1小時(shí)晶體-細(xì)胞粘附測定，通過siRNA敲低蛋白質(zhì)HSP90用作COM晶體受體。2018維奈法特A等[41]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（整個(gè)細(xì)胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：1小時(shí)晶體-細(xì)胞粘附測定、晶體內(nèi)化測定、抗體中和測定PMCA2用作COM晶體受體。COM晶體對單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響2010辛格托N等[42]細(xì)胞：U937細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COM

培養(yǎng)：24小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜9種上調(diào)蛋白質(zhì)和13種下調(diào)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周期，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，碳水化合物代謝，脂質(zhì)代謝，mRNA加工以及蛋白質(zhì)合成，穩(wěn)定和降解中起作用。2013辛格托N等[43]]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（全細(xì)胞）

晶體：100μg/mL COM

孵育：24小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜，吞噬作用測定，通過SIRNA敲低蛋白質(zhì)7種上調(diào)和7種下調(diào)蛋白質(zhì)，控制細(xì)胞結(jié)構(gòu)，碳水化合物代謝，DNA/RNA加工，蛋白質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)。HSP90在巨噬細(xì)胞的吞噬體形成和吞噬活性中起著至關(guān)重要的作用。COM晶體對分泌組和外泌體蛋白質(zhì)組的影響2016蔣宗華等[13]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（分泌組）

晶體：100μg/mL COM

培養(yǎng)：20小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF MS/MS，晶體遷移測定，細(xì)胞遷移測定COM晶體誘導(dǎo)2個(gè)來自腎小管細(xì)胞的分泌蛋白增加和4個(gè)減少。分泌性烯醇化酶-1的增加反過來又通過ECM增強(qiáng)了COM晶體的侵入。2016辛提普倫格拉特K等[44]]細(xì)胞：U937細(xì)胞（分泌組）

晶體：100μg/mL COM

孵育：16小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜COM晶體誘導(dǎo)了14個(gè)與U937單核細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活相關(guān)的分泌蛋白增加和4個(gè)減少。增加的HSP90局限于細(xì)胞表面。2018辛格托N等[45]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（外泌體）

晶體：100μg/mL COM

孵育：24小時(shí)2-DE，深紫色染色，納米LC-ESI-ETD MS/MS，細(xì)胞遷移測定，吞噬作用測定，通過siRNA敲低蛋白質(zhì)2種上調(diào)和4種下調(diào)外泌體蛋白。來自晶體相互作用的巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移/活化和巨噬細(xì)胞的吞噬活性。siRNA敲低了維生素素，成功地抑制了來自COM晶體暴露巨噬細(xì)胞的外泌體的這種作用。2018辛格托N等[46]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（外泌體）

晶體：100μg/mL COM

孵育：24小時(shí)納米LC-ESI-Qq-TOF，細(xì)胞遷移試驗(yàn)，晶體結(jié)合試驗(yàn)，晶體遷移試驗(yàn)7種上調(diào)和19種下調(diào)外泌體蛋白。來自晶體相互作用巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，增強(qiáng)腎小管細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生，與COM晶體具有更大的結(jié)合能力，并通過ECM激活晶體入侵。

2.不同劑量和類型的CaOx晶體對腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響

應(yīng)用于晶體-細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)的首次研究是在2008年完成的[24]。在這項(xiàng)工作中，仔細(xì)建立了研究模型，表明劑量為100μg/mL（每體積培養(yǎng)基）的COM晶體在48小時(shí)的潛伏期不會(huì)對腎小管細(xì)胞造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，并且細(xì)胞死亡百分比不會(huì)增加。因此，由COM晶體誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化反映了細(xì)胞對COM晶體的反應(yīng)，而不是它們的細(xì)胞毒性作用。此外，掃描電子顯微鏡（SEM）在與細(xì)胞孵育后顯示出COM晶體邊界的扭曲，首次表明晶體-細(xì)胞相互作用具有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。使用二維凝膠電泳（2-DE）與Sypro Ruby熒光染色，然后進(jìn)行四極桿飛行時(shí)間（Q-TOF）質(zhì)譜（MS）和串聯(lián)MS（MS/MS），鑒定了11種上調(diào)和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，它們在轉(zhuǎn)錄/翻譯，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝和生長，核和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，運(yùn)輸，應(yīng)激反應(yīng)和生物合成中起作用。其中一些蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)通過二維（2-D）蛋白質(zhì)印跡得到證實(shí)[24]。

隨后，進(jìn)行了一項(xiàng)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究[29]，以評估100μg/mL COM晶體對線粒體蛋白質(zhì)組的影響以及使用高度純化的線粒體分離方法暴露于晶體48小時(shí)的腎小管細(xì)胞的功能[47]。使用2-DE與深紫色熒光染色的比較分析，然后是Q-TOF MS和MS/MS分析，確定了12種上調(diào)和3種下調(diào)線粒體蛋白，它們調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，代謝和能量產(chǎn)生。此外，Oxyblot檢測表明，COM晶體誘導(dǎo)線粒體功能障礙和氧化修飾蛋白在細(xì)胞中的積累[29]。

另一項(xiàng)使用較高劑量（200μg/mL）COM晶體的研究顯示，當(dāng)腎小管細(xì)胞與COM晶體和2 mM草酸鹽一起孵育較短時(shí)間（僅12小時(shí)）時(shí)，細(xì)胞死亡不會(huì)增加[27]。使用2-DE銀染色，然后液相色譜法結(jié)合電噴霧電離MS/MS（LC-ESI MS/MS），數(shù)據(jù)顯示9種上調(diào)和3種下調(diào)細(xì)胞蛋白，其作用于能量產(chǎn)生，細(xì)胞增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，鈣平衡和蛋白質(zhì)合成。

使用高得多劑量（1000μg/mL）的COM晶體，細(xì)胞在與晶體孵育48小時(shí)后，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重細(xì)胞毒性，總細(xì)胞死亡增加[25]。使用2-DE與西普羅紅寶石染色，然后進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS分析，鑒定出25種上調(diào)和23種下調(diào)蛋白。EZRIN、烯醇化酶-1和膜聯(lián)蛋白-A1水平的降低通過2-D蛋白質(zhì)印跡得到證實(shí)。有趣的是，伴侶被上調(diào)，而其他參與蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)被下調(diào)[25]。最近使用各種測定方法進(jìn)行了功能研究，以確定該表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的生物學(xué)相關(guān)性[31]。最初，所有顯著改變的蛋白質(zhì)被提交給STRING生物信息學(xué)工具[48]以獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，其揭示了細(xì)胞增殖/傷口愈合，氧化應(yīng)激/線粒體功能以及細(xì)胞連接復(fù)合物/完整性是顯著改變蛋白質(zhì)的主要生物學(xué)功能。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，用1000μg/mL COM晶體處理的細(xì)胞毒性腎小管細(xì)胞在細(xì)胞增殖、傷口愈合能力、經(jīng)上皮阻力（TER）以及閉塞-1（ZO-1）和信號蛋白RhoA的緊密連接蛋白水平方面均有所下降。相反，氧化修飾蛋白的水平升高。雖然ATP合酶α亞基前體減少，但參與能量產(chǎn)生和穩(wěn)態(tài)的其他線粒體蛋白（例如烏頭酶、腺苷酸激酶2、泛醇-細(xì)胞色素-c還原酶）增加[25]。結(jié)果，COM處理的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ATP水平升高[31]。這些數(shù)據(jù)可能反映了COM晶體誘導(dǎo)的微管毒性期間發(fā)生的細(xì)胞過程[31]。

蛋白質(zhì)組學(xué)還應(yīng)用于研究暴露于無毒劑量（100μg/mL）的COD晶體48小時(shí)后腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化[26]。使用2-DE和Sypro Ruby染色，然后進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS分析，數(shù)據(jù)顯示5種上調(diào)和5種下調(diào)蛋白質(zhì)控制細(xì)胞代謝、結(jié)構(gòu)、完整性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)[26]。隨后，研究了100μg/mL COD晶體誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞糖蛋白組的變化[28]。使用2-DE和Pro-Q祖母綠糖蛋白染色，然后使用Sypro Ruby總蛋白染色進(jìn)行歸一化，Q-TOF MS和MS/MS鑒定了16個(gè)顯著改變的糖蛋白，包括負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞解離的3個(gè)蛋白酶體亞基的糖型和在細(xì)胞完整性中起作用的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白3（ARP3）。這些數(shù)據(jù)表明，COD晶體導(dǎo)致細(xì)胞解離并降低細(xì)胞完整性[28]。

此外，還對暴露于不同劑量和類型的CaOx晶體后腎小管細(xì)胞的功能擾動(dòng)進(jìn)行了比較分析[30]。表達(dá)數(shù)據(jù)的比較表明，與低劑量相比，這些晶體的高劑量引起細(xì)胞蛋白質(zhì)組更明顯的變化，并且COM比COD更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變。功能分析顯示，在用高劑量COM和COD處理的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)ATP，氧化修飾蛋白和細(xì)胞死亡水平較高，但泛素化蛋白水平較低。COM晶體也誘導(dǎo)比COD更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。用抗氧化劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可以降低晶體誘導(dǎo)的氧化修飾蛋白的積累和細(xì)胞的晶體結(jié)合能力。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了高劑量與低劑量以及COM與COD晶體在腎小管細(xì)胞中誘導(dǎo)功能性擾動(dòng)的差異效應(yīng)。研究結(jié)果還表明，氧化應(yīng)激可能在用這些不同劑量/類型的晶體處理的細(xì)胞的晶體結(jié)合能力中起重要作用[30]。

然而，應(yīng)該注意的是，COM/COD晶體的劑量及其暴露于所有上述體外研究中應(yīng)用的細(xì)胞的時(shí)間可能并不完全代表結(jié)石成型劑中的體內(nèi)狀況，這可能伴隨著腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制的另一個(gè)模型，即Randall的斑塊模型。目前，晶體-細(xì)胞相互作用的體內(nèi)研究似乎尚未用于腎結(jié)石研究，因?yàn)橄拗疲▽?shí)際上缺乏）跟蹤體內(nèi)晶體-細(xì)胞相互作用的技術(shù)。當(dāng)這種技術(shù)可用時(shí)，腎結(jié)石形成的致病機(jī)制將更加清晰。

轉(zhuǎn)到(G)：

3.腎小管細(xì)胞頂端表面COM晶體受體的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

腎結(jié)石研究在細(xì)胞水平上取得重大飛躍的另一步是開發(fā)一種簡單但有效的剝離方法來分離和純化極化腎小管細(xì)胞的頂膜[49]。這種新方法主要依賴于所施加的表面（例如，Whatman濾紙，硝酸纖維素膜，玻璃紙或玻璃蓋玻片）的吸附能力，以利用這些表面和頂端膜之間的含水親和力和離子相互作用與頂端膜粘附。在測試的這4個(gè)表面中，濾紙是分離和純化頂端膜的最有效一種，而基底外側(cè)膜蛋白沒有任何污染，這已通過免疫印跡和免疫熒光染色證實(shí)[49]。與傳統(tǒng)的生化測定（主要使用基于離心的方法）相比，剝離方法在分離/純化頂端膜方面要有效得多。

該剝離方法用于分離極化腎小管細(xì)胞頂膜的高度純化部分，然后鑒定細(xì)胞表面的潛在COM晶體受體[32]。將回收的蛋白質(zhì)重懸于人工尿液中，并與COM晶體一起孵育過夜。洗滌和洗脫后，凝膠增強(qiáng)液相色譜法，然后串聯(lián)MS（GeLC-MS/MS）共鑒定出96個(gè)潛在的COM晶體受體。其中，膜聯(lián)蛋白II作為COM晶體受體的作用通過晶體-細(xì)胞粘附試驗(yàn)驗(yàn)證，然后使用特異性抗膜聯(lián)蛋白II抗體進(jìn)行中和[32]。此外，其他COM晶體受體也在隨后的研究中得到證實(shí)，包括α烯醇化酶[34，36]、膜聯(lián)蛋白A1[33，35]、熱休克蛋白90（HSP90）[37，40]和質(zhì)膜Ca2+異肽酶2（PMCA2）[41]。

其他不作為COM晶體受體但其作用與各種COM晶體受體相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括α-微管蛋白和層粘連蛋白A/C.A-微管蛋白（一種細(xì)胞骨架蛋白）被鑒定為使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法用1000μg/mL COM晶體處理的腎小管細(xì)胞中的下調(diào)蛋白質(zhì)之一[25]，并作為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)[38]].α-微管蛋白的過表達(dá)導(dǎo)致3種COM晶體受體的下調(diào)，包括α烯醇化酶、熱休克蛋白70（HSP70）和HSP90，并且細(xì)胞的晶體結(jié)合能力下降[38]。相比之下，另一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，層粘連蛋白A/C（一種核層蛋白）是用100μg/mL COM晶體處理的腎小管細(xì)胞中的上調(diào)蛋白質(zhì)之一[24]，并作為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)[39]。小干擾RNA（siRNA）敲低層粘連蛋白A/C導(dǎo)致4種COM晶體受體（包括維門汀、α烯醇化酶、S100和膜聯(lián)蛋白A2）的水平降低，并且細(xì)胞的晶體結(jié)合能力下降[39]。這些數(shù)據(jù)表明，層粘連蛋白A/C具有各種功能，包括調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的表達(dá)。對上述COM晶體受體及其調(diào)節(jié)劑或相關(guān)蛋白質(zhì)的表征可能導(dǎo)致進(jìn)一步發(fā)展策略，通過阻斷COM晶體粘附在細(xì)胞上和晶體保留在腎內(nèi)來防止腎結(jié)石的形成。

轉(zhuǎn)到(G)：

4.COM晶體對單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響

CaOx晶體不僅與腎小管細(xì)胞相互作用，還與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用，它們在進(jìn)一步加重腎結(jié)石形成的炎癥過程中起重要作用。因此，蛋白質(zhì)組研究已經(jīng)研究了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞響應(yīng)COM晶體的作用。將人單核細(xì)胞U937細(xì)胞與100μg/mL COM晶體一起孵育24小時(shí)，并檢查細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化[42]。使用2-DE進(jìn)行深紫色熒光染色，然后進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS分析，結(jié)果顯示9種蛋白質(zhì)的水平升高，13種蛋白質(zhì)的水平降低，這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、mRNA加工以及蛋白質(zhì)合成、穩(wěn)定和降解中的作用[42]。

后來，采用類似的方法研究人巨噬細(xì)胞與100μg/mL COM晶體相互作用24小時(shí)后細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化[43]。比較蛋白質(zhì)組分析揭示了7種上調(diào)和7種下調(diào)蛋白質(zhì)，它們控制細(xì)胞結(jié)構(gòu)，碳水化合物代謝，DNA/RNA加工，蛋白質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)。有趣的是，蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明，HSP90直接與β肌動(dòng)蛋白和α微管蛋白相互作用，所有這些相互作用的伙伴在COM處理的巨噬細(xì)胞中都上調(diào)。功能研究表明，只有肌動(dòng)蛋白與HSP90共定位在被吞噬的COM晶體周圍，形成吞噬體結(jié)構(gòu)。siRNA對HSP90的敲低抑制了吞噬體的形成以及COM晶體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬和遷移活性。這些數(shù)據(jù)表明，HSP90不僅作為COM晶體受體，而且在巨噬細(xì)胞的吞噬體形成和吞噬活性中也起著至關(guān)重要的作用[43]。

轉(zhuǎn)到(G)：

5.COM晶體對分泌組和外泌體蛋白質(zhì)組的影響

除了COM晶體誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變外，還使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了晶體-細(xì)胞相互作用對分泌組的影響。對于腎小管細(xì)胞，100μg/mL COM晶體導(dǎo)致2種分泌蛋白水平升高，4種分泌蛋白水平降低[13]。有趣的是，使用先前建立的基于纖溶酶原-纖溶酶活性的晶體遷移測定法進(jìn)行了功能研究[50]。數(shù)據(jù)顯示，分泌性烯醇化酶-1的增加反過來又通過ECM促進(jìn)COM晶體侵襲和單核細(xì)胞的遷移[13]。對于人單核細(xì)胞，用U937單核細(xì)胞孵育100μg/mL COM晶體16 h可誘導(dǎo)細(xì)胞中14個(gè)分泌蛋白增加和4個(gè)減少[44]。有趣的是，一項(xiàng)免疫熒光研究檢測到細(xì)胞表面的HSP90增加，這表明其增加的分泌可能來自非經(jīng)典分泌途徑[44]。

為了證實(shí)COM可以通過非經(jīng)典分泌途徑誘導(dǎo)分泌組的變化，隨后的研究調(diào)查了來自人類巨噬細(xì)胞的外泌體蛋白質(zhì)組的改變。使用基于凝膠的[45]和無凝膠[46]定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，鑒定出許多顯著改變的外泌體蛋白。有趣的是，暴露于COM晶體的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），這是炎癥小體活化標(biāo)志物之一[51，52]。此外，來自這些晶體相互作用巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移/活化，單核細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的白細(xì)胞介素-8（IL-8）（一種促炎細(xì)胞因子），其作為旁分泌激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性[45]。siRNA敲低了一種上調(diào)蛋白（維門汀），成功地抑制了來自COM晶體暴露巨噬細(xì)胞的外泌體的這種作用[45]。此外，來自這些晶體相互作用巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，增強(qiáng)腎小管細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生，與COM晶體的結(jié)合能力更強(qiáng)，并通過ECM激活晶體入侵[46]。

轉(zhuǎn)到(G)：

6.結(jié)論

在過去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已成功應(yīng)用于腎結(jié)石研究，旨在更好地了解腎結(jié)石形成的致病機(jī)制，特別是在晶體-細(xì)胞相互作用（表1).這些研究的第一階段主要涉及與COM晶體相互作用后腎小管細(xì)胞中改變的全細(xì)胞蛋白質(zhì)組的表征。隨后，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了細(xì)胞與COM晶體相互作用后線粒體蛋白質(zhì)組變化和線粒體功能障礙的其他信息。此外，對不同劑量和類型的CaOx晶體對腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響的功能研究，使得更好地理解受晶體-細(xì)胞相互作用影響的腎小管細(xì)胞的表達(dá)和功能擾動(dòng)（見第2節(jié)）。在開發(fā)出一種簡單而高效的方法來從極化的腎小管細(xì)胞中純化頂膜之后，該領(lǐng)域發(fā)生了一個(gè)巨大的飛躍。特別是，蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了大量潛在的COM晶體受體，然后在隨后的幾項(xiàng)研究中進(jìn)行了功能驗(yàn)證。這些發(fā)現(xiàn)對于進(jìn)一步制定通過阻斷致病晶體與靶腎小管細(xì)胞之間的結(jié)合來預(yù)防腎結(jié)石形成的策略非常重要（見第3節(jié)）。除腎小管細(xì)胞外，蛋白質(zhì)組學(xué)還應(yīng)用于研究人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化，這些變化導(dǎo)致更清楚地了解消除粘附和內(nèi)化CaOx晶體和炎癥反應(yīng)的機(jī)制（見第4節(jié)）。此外，還開發(fā)了幾種功能測定方法，以解決從蛋白質(zhì)組學(xué)研究的初始階段鑒定的表達(dá)數(shù)據(jù)的功能意義。例如，鑒定由COM晶體誘導(dǎo)的改變的分泌蛋白，這反過來又加劇了通過ECM的晶體入侵。最后，最近關(guān)于巨噬細(xì)胞外泌體在腎結(jié)石形成炎癥級聯(lián)中的作用的知識提供了額外的新信息，以更好地了解晶體-細(xì)胞相互作用期間的炎癥級聯(lián)反應(yīng)（見第5節(jié)）。綜上所述，所有這些發(fā)現(xiàn)都有助于更好地了解腎結(jié)石病的致病機(jī)制，特別是在晶體-細(xì)胞相互作用的步驟中。此外，這些發(fā)現(xiàn)還可能導(dǎo)致開發(fā)新的策略來預(yù)防新的和/或復(fù)發(fā)的腎結(jié)石的形成。