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分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——材料和方法
來源：上海謂載 瀏覽 1058 次 發(fā)布時間:2021-12-01
材料和方法
所有溶液均使用無熱原Milli-Q水（微孔）制備。 從西格瑪化學(xué)公司購買了HPLC級三苯醚、聚氧乙烯基-9-月桂基醚、C12（EO）9、二吡啶基磷脂酸（DMPA）、2-氨基-2-甲基丙烷-1-醇（AMPOL）、對硝基苯磷酸酯（PNPP）和異硫氰酸熒光素。從默克公司獲得氯仿、甲醇和氯化鎂。 所有其他試劑均具有最高的市售純度。
堿性磷酸酶的制備。 該酶由富含堿性磷酸酶的大鼠骨板膜制備。37個膜結(jié)合堿性磷酸酶（0.2 mg/mL）樣品在25°C條件下，在恒定攪拌下，用1%（最終濃度）C12-（EO）9（polidocanol）溶解2 h。 在30000g離心2h后，將溶解洗滌劑形式的堿性磷酸酶（DSAP）濃縮在YM-5 Amicon過濾器上，并用5mmol透析過夜 ● L-1 Tris“HCl緩沖液，pH值7.5，含2 mmol ● L-1 MgCl2，150 mmol ● L-1氯化鈉和0.01%（v/v）聚二十二烷醇。 最后，在Sephacryl S-300柱（130×1.7cm）上純化DSAP，在相同的緩沖液中平衡和洗脫。 在非變性條件下純化酶的聚環(huán)丙酰胺凝膠電泳38顯示出與酶活性一致的單一蛋白帶。 在均相溶液中PNPP水解時測得的純化DSAP的比活性為1482.0 nmol的PNP-“min-1”mg-1（PNP-）對硝基苯酚（PNPP的水解產(chǎn)物），在先前報告的范圍內(nèi)。39在0.01%（v/v）的存在下，將酶保持在碎冰中 polidocanol的有效期為1個月，沒有明顯的活性損失。
朗繆爾單分子膜和表面壓力面積等溫線。 純DMPA和DMPA/DSAP混合單分子膜的制備方法是將其溶液（20μL用于1×10-3 mol L-1 DMPA，100μL用于7.3μg/mL DSAP）分散在槽（芬蘭Kibron，體積為70 mL，總面積為115 cm2）中包含的亞相上，并由2 mmol組成 ● 50 mmol中的L-1 MgCl2 ● L-1氨酚緩沖液，pH 9.4（DSAP催化活性的最佳值），導(dǎo)致初始零表面壓力。 DMPA溶液在氯仿/甲醇混合物（3:1）中制備，如別處所述。40對于脂質(zhì)/蛋白質(zhì)混合單層，DSAP溶液在5 mmol中制備 ● 含有2 mmol的pH值為7.5的L-1 Tris“HCl緩沖液 ● DMPA單分子膜形成后，在界面擴(kuò)散L-1MgCl2和0.01%polidocanol（DSAP儲存的最佳條件），在混合單分子膜中提供6.12 ng/cm2的初始酶表面密度（以1:3500的摩爾比例，蛋白質(zhì)/脂質(zhì)）。 大約10-15分鐘用于表面壓力穩(wěn)定、溶劑蒸發(fā)和單層組分的橫向擴(kuò)散。 然后通過使用側(cè)向屏障壓縮單層（純或混合），直至達(dá)到塌陷。 為了比較純脂質(zhì)和混合蛋白質(zhì)/脂質(zhì)單層的曲線，將兩種等溫線記錄為平均脂質(zhì)分子面積的函數(shù)。 單層實(shí)驗(yàn)在37±1°C下進(jìn)行。
為了測試非離子表面活性劑的影響，記錄了在2.5×10-7mol/L聚對苯二甲酸乙二醇酯水溶液上DMPA單層的等溫線。 這實(shí)際上與在純水上得到的DMPA一致。
酶活性。 在形成DSAP/DMPA混合單層后，界面被壓縮，直到達(dá)到所需的表面壓力。 將濃縮PNPP溶液注入亞相，以達(dá)到1 mmol的最終濃度 ● L-1（酶飽和條件）。 在37°C下，通過測量反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯酚離子（E 410nm，pH9.4）17600 mol“L-1”cm-1的吸光度，在亞階段監(jiān)測底物水解。 這些測量是通過二極管陣列分光光度計（Spectropete，世界精密儀器公司，美國）的采樣微升尖端完成的。 該測量裝置由一個位于微移液管頂端的特殊微室組成，該微室配有一根發(fā)射收集光纖和一個微插入器。 在整個實(shí)驗(yàn)過程中，在連續(xù)攪拌下，微細(xì)胞尖端直接浸入單層亞相。 在適當(dāng)?shù)臅r間間隔內(nèi)，自動提取約2μL亞相的等份，并通過計算機(jī)記錄整個吸收光譜進(jìn)行分析，然后將提取體積返回亞相，保持槽體積恒定。
在沒有酶或單層的情況下進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，以確保估計的酶活性完全是由于界面上存在的酶。簡而言之，實(shí)驗(yàn)中使用的槽有三個隔間，通過狹縫從一側(cè)連接到另一側(cè)（0.5 mm寬，2 mm長，0.2 mm深）在接口水平面。因此，有兩個“橫向”隔室和一個“中央”隔室。隔室的墻壁防止“通信”在亞相之間，我們可以認(rèn)為它們是孤立的。DMPA和酶在槽上擴(kuò)散，并在一定時間內(nèi)（20分鐘）擴(kuò)散。允許溶劑蒸發(fā)和平衡。之后，使用兩個橫向屏障壓縮混合單層，將其限制在中央隔室的界面上。然后將底物PNPP注入三個隔室的亞相，并通過監(jiān)測ab測定所有隔室中的酶活性PNPP水解產(chǎn)物的吸附性。對照實(shí)驗(yàn)也在均相介質(zhì)中進(jìn)行，使用1mmol●L-1 PNPP和2 mmol●50 mmol中的L-1 MgCl2●L-1 AMPOL緩沖液，pH值9.4（酶活性評估和底物飽和的最佳條件）。Langmuir單分子膜的酶活性以溶液中測定的百分比表示（約1480 nmol PNP-“min-1”mg-1酶）。
在玉蘭油玉蘭油玉蘭油（Paulo）、巴西RieBiRa Pro to Pror大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室中，用熒光顯微鏡（OLYBUS B-MAX）獲得了混合單分子層的熒光顯微照片。配備高靈敏度SIT攝像機(jī)（濱松C-24）.使用透析共軛技術(shù)41用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的DSAP作為熒光探針?？紤]到標(biāo)記可使蛋白質(zhì)變性，僅1 mol%的標(biāo)記蛋白質(zhì)與天然DSAP混合，這足以在空氣/水界面識別富含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。
分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——摘要、介紹
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