類囊體膜是進(jìn)行光合作用原初光能轉(zhuǎn)化的場(chǎng)所，包括四種重要的光合膜蛋白復(fù)合物：光系統(tǒng)(PS)I、PSII、細(xì)胞色素b6/f和ATP合酶復(fù)合物，在其中植物能夠完成捕獲光能并轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的過(guò)程[1]。利用光合膜蛋白進(jìn)行電荷分離產(chǎn)生光電流的特性，研究者將分離的類囊體膜[2]、PSI[3-4]、PSII復(fù)合物[5]、細(xì)菌反應(yīng)中心[6-7]等光合膜蛋白組裝成光電器件，為制備新型生物太陽(yáng)能電池奠定了基礎(chǔ)，但這些光合膜蛋白器件的光電轉(zhuǎn)化效率很低，且穩(wěn)定性也有待提高。

LB(Langmuir-Blodgett)膜技術(shù)是獲得有序排列的光合膜蛋白單分子層的重要手段，在單分子層上蛋白復(fù)合物高度有序的結(jié)構(gòu)，保證了色素分子之間能夠進(jìn)行有效的能量傳遞，并有助于使復(fù)合物具有較高的光熱穩(wěn)定性[8]。何靳安等[9]將R-藻紅蛋白(R-PE)單分子膜通過(guò)LB技術(shù)制備在SnO2光學(xué)透明電極(OTE)上，組成的光電池能夠產(chǎn)生光生電流，具有較好的光學(xué)穩(wěn)定性。

石莼(Ulva lactuca)是一類常見(jiàn)的潮間帶大型海洋綠藻，已有研究表明石莼對(duì)光和溫度等環(huán)境變動(dòng)具有較強(qiáng)的耐受性[10-11]。此外，本課題組的前期研究也表明，與菠菜相比石莼的類囊體膜蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性。本研究嘗試用LB膜技術(shù)分別將菠菜和海洋綠藻石莼的類囊體膜固定在納米ZnO上，組裝成光電池，并且比較了其光電性質(zhì)，以期為開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性和效率更高的生物光電器件提供參考。

1材料與方法

1.1菠菜和石莼類囊體膜的制備

菠菜類囊體膜的分離方法按照Berthold等[12]的方法加以改進(jìn)。取新鮮菠菜葉片除去葉柄、葉脈，清洗干凈，在4℃下暗適應(yīng)放置5 h以上。在含20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，0.4 mol/L蔗糖，5 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA的緩沖液中用搗碎機(jī)搗碎葉片，并用紗布過(guò)濾，所得濾液于220g離心2 min;上清液于1 500g離心10 min;沉淀加入含20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，5 mmol/L MgCl2·6H2O，15 mmol/L NaCl的緩沖液懸浮勻漿，200g離心2 min去沉淀;上清液5 000g離心15 min，沉淀用含20 mmol/L MES pH 6.5，0.4 mol/L蔗糖，35 mmol/L NaCl的保存緩沖液懸浮勻漿，即為菠菜類囊體膜。

石莼采自青島金沙灘，將新鮮葉片清洗干凈并用蒸餾水洗兩遍，加入含20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)，0.2 mol/L蔗糖，10 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA的緩沖液用搗碎機(jī)破碎，紗布過(guò)濾后所得濾液于220g離心2 min，上清液于10 000g離心10 min;沉淀用含10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)的緩沖液懸浮勻漿，250g離心2 min去沉淀;上清液12 000g離心15 min，沉淀用含20 mmol/L MES pH 6.5，0.4 mol/L蔗糖，35 mmol/L NaCl的保存緩沖液懸浮勻漿，并注意將白色淀粉部分去除，所得為石莼類囊體膜。

1.2 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析在NuPAGE 4%～12%Bis-Tris Mini Gel預(yù)制膠(Invitrogen，USA)上進(jìn)行。在樣品中加入NuPAGE LDS sample Buffer和NuPAGE Reducing Agent(Invitrogen)，70℃加熱10 min，短暫離心后上樣，每孔道上樣20μL，200 V恒電壓電泳。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3納米ZnO的制備

把摻氟氧化錫(SnO2：F，F(xiàn)TO)導(dǎo)電玻璃(日本NSG株式會(huì)社)用超聲清洗，在玻璃上滴加1 mmol/L Zn(Ac)2·2H2O乙醇溶液后用N2吹干，反復(fù)5次，放入馬弗爐中350℃加熱20 min，再把處理好的FTO玻璃放入含25 mmol/L C6H12N4和25 mmol/L Zn(NO3)2的反應(yīng)液中在75℃恒溫振蕩器中反應(yīng)9～12 h，即可在FTO導(dǎo)電玻璃上合成ZnO納米線。

1.4納米ZnO的原子力顯微鏡和掃描電鏡表征

用Nanoscope IVa原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)(Veeco/Digital Instruments，santa Barbara，USA)和表征ZnO在FTO導(dǎo)電玻璃上的分布情況和均勻性。采用Veeco TESP型探針，操作頻率為300～350 kHz，彈性常數(shù)為20～80 N/m。

用日立S-4800冷場(chǎng)掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)觀察ZnO在FTO導(dǎo)電玻璃表面上的生長(zhǎng)情況，電壓5 kV。

1.5類囊體膜LB膜的制備

參照Li等[13]的方法，以0.5 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)作為亞相，3%(V/V)乙醇-水溶液作為鋪展劑，把60μL濃度為1.5 mg/mL的類囊體膜緩慢均勻地滴入Micro Trough X LB膜分析儀(芬蘭Kibron)槽內(nèi)的亞相表面，待其在亞相表面擴(kuò)散約20 min后，壓膜速率為1 mm/min，壓縮單分子層膜至表面壓為30 mN/m，保持30 min后，用垂直提拉法將膜轉(zhuǎn)移到納米ZnO表面。在納米ZnO上沉積1、3、5層的LB膜分別用來(lái)進(jìn)行熒光發(fā)射光譜和光電性能檢測(cè)。

1.6熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)

樣品在室溫下用FluoroMax-4熒光光譜儀(Horiba Jobin Yvon)檢測(cè)，436 nm激發(fā)，狹縫寬度2 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍625～750 nm。

1.7光電池的組裝及光電性能的檢測(cè)

將類囊體膜LB膜的納米ZnO導(dǎo)電玻璃膜面朝上放在潔凈的水平基面上，并把鍍Pt的FTO玻璃(大連七色光太陽(yáng)能科技開(kāi)發(fā)有限公司)作為對(duì)電極放在上面，將具有開(kāi)口的熱封膜(膜厚60μm，內(nèi)孔尺寸5 mm×5 mm)置于兩電極之間，形成一定的空間，便于滴加電解質(zhì)。把兩個(gè)玻璃片微微錯(cuò)開(kāi)，各自留出一定的導(dǎo)電部分，以利于電池測(cè)試。用兩個(gè)長(zhǎng)尾夾把電池夾住，再滴入少量電解質(zhì)溶液，由于毛細(xì)管原理，電解質(zhì)溶液很快在兩個(gè)電極之間擴(kuò)散均勻，封孔后即可進(jìn)行光電性能檢測(cè)。在本實(shí)驗(yàn)中參照Abe等[14]和Lemieux等[15]的方法，稍加改動(dòng)，以pH 7.2的PBS緩沖液作為電池中的電極緩沖液。

光電性能的檢測(cè)在美國(guó)頤光科技有限公司(Crown Tech)太陽(yáng)能電池I-V特性測(cè)試系統(tǒng)IV Test Station 2000上進(jìn)行，電壓/電流控制和測(cè)量采用Keithley Model 2400 SourceMeter，在模擬太陽(yáng)光(AM 1.5，100 mW/cm2)照射下測(cè)定組裝電池的I-V特征曲線。得出開(kāi)路電壓Voc、短路電流Isc、最大輸出功率Pout，利用公式(1)和(2)計(jì)算電池的填充因子FF和光電轉(zhuǎn)換效率η。

其中Vmax和Imax為最大輸出功率時(shí)對(duì)應(yīng)的電壓和電流，Pin為入射光強(qiáng)。

2結(jié)果與討論

2.1類囊體膜的提取和多肽組成

與高等植物菠菜相比，海洋綠藻石莼含多糖和淀粉較多，葉綠體較小，因此在類囊體膜的制備上略有不同，收集石莼類囊體膜時(shí)所需的離心速度較高，在勻漿時(shí)需要注意將白色沉淀去除。將提取的石莼和菠菜的類囊體膜進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。石莼和菠菜類囊體膜的多肽組分相似，都包括PSI的組分PsaA/B和LHCI，以及PSII的組分即PSII反應(yīng)中心的D1、D2蛋白和內(nèi)周天線蛋白CP47、CP43和外周天線蛋白LHCII等。

圖1石莼和菠菜類囊體膜的SDS-PAGE分析

2.2納米ZnO的制備和表征

納米ZnO是一種重要的光催化材料，具有成本低廉、生物相容性較好和電子傳遞特性較高的優(yōu)點(diǎn)，因此在太陽(yáng)能電池、傳感器、光電器件等方面都有廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用水熱合成法定向生長(zhǎng)ZnO納米線并用原子力顯微鏡(AFM)和掃描電鏡(SEM)對(duì)其進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2和圖3所示。

ZnO晶核在FTO導(dǎo)電玻璃表面的分布情況和分布的粒徑范圍對(duì)納米線的生長(zhǎng)及性能有重要的影響。圖2顯示1 mmol/L的Zn(Ac)2乙醇溶液接種5次，晶核在FTO導(dǎo)電玻璃表面分布比較均勻，粒徑的分布情況也較好，一般在20～40 nm。圖3顯示納米ZnO纖維在FTO玻璃上的生長(zhǎng)情況，納米ZnO纖維垂直FTO向上生長(zhǎng)，長(zhǎng)度基本一致，形成了均勻分布的納米簇，增加了與蛋白的接觸面積，減少了電流傳遞時(shí)的電阻，從而可以提高光電池的光電轉(zhuǎn)化效率。

2.3類囊體膜在納米ZnO上的吸附及光電性質(zhì)

蛋白在固體界面上的吸附有很多形式，如果蛋白在固體界面自由吸附，往往會(huì)形成堆積或者分布不均勻，使得在光電實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到的結(jié)果不穩(wěn)定。因此，嘗試用LB膜技術(shù)將類囊體膜組裝在納米ZnO上，以得到有序排列的蛋白分子組裝體系。

圖2原子力顯微鏡觀察在FTO上的納米ZnO

圖3納米ZnO的掃描電子顯微鏡照片，45o側(cè)視圖

圖4不同層石莼類囊體膜LB膜在納米ZnO上的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，436 nm激發(fā)

表1不同層數(shù)類囊體膜LB膜組裝成光電池的光電性能參數(shù)

圖4是石莼類囊體膜LB膜在納米ZnO上的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，類囊體膜的最大熒光發(fā)射峰在683 nm，隨著類囊體膜在ZnO上吸附層數(shù)的增加熒光發(fā)射強(qiáng)度增大。菠菜類囊體膜的熒光發(fā)射光譜表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)(結(jié)果未顯示)。

已有報(bào)道可以將類囊體膜組裝成不同的電化學(xué)器件，Abe等[14]通過(guò)靜電吸附將螺旋藻的類囊體膜和聚離子復(fù)合聚乙烯亞胺(PEI)組裝在金電極表面，具有光電化學(xué)活性，并且能夠被除草劑抑制。將類囊體膜包埋在白蛋白-戊二醛交聯(lián)介質(zhì)中組裝成光電池，與天然類囊體膜相比，對(duì)高溫、高pH和高光強(qiáng)脅迫條件具有更強(qiáng)的耐受性[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用LB膜技術(shù)可以將類囊體膜組裝到納米ZnO上，而且能夠產(chǎn)生光電流。由不同層數(shù)的石莼和菠菜類囊體膜LB膜在ZnO上組裝成光電池的I/V曲線如圖5、圖6所示，表1列出了各光電池的光電性能參數(shù)。類囊體膜LB膜的層數(shù)顯著影響了光電池的光電轉(zhuǎn)化效率η值，隨著層數(shù)的增加，光電轉(zhuǎn)化效率大大增加。Abe等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，用靜電吸附法得到的類囊體膜電化學(xué)器件產(chǎn)生的光電流隨著吸附層數(shù)的增加而增加。

圖5不同層數(shù)菠菜類囊體膜LB膜組裝成光電池的I-V曲線

圖6不同層數(shù)石莼類囊體膜LB膜組裝成光電池的I-V曲線

此外，海洋綠藻石莼類囊體膜組裝的光電池光電轉(zhuǎn)化效率明顯高于菠菜類囊體膜。影響光電轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，類囊體膜的光合電子傳遞活性、類囊體膜與氧化鋅的吸附作用、電子從膜到工作電極的擴(kuò)散等都可能會(huì)影響光電流的產(chǎn)生速率。已有報(bào)道表明，綠藻石莼具有與高等植物不同的熒光誘導(dǎo)特性[16]、色素組成、類囊體膜垛疊方式以及熒光發(fā)射特性[17-19]。石莼的最大熒光量子產(chǎn)額高于其他藻類，其生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量也高于很多種屬[20-21]。石莼類囊體膜組裝的光電池光電轉(zhuǎn)化效率較高與其類囊體膜的特性具有怎樣的關(guān)系，該機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。